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骨肉瘤干细胞的研究进展

发布日期:2019-10-27 00:44   来源:未知   阅读:

  •   骨肉瘤(OS)是儿童和青少年中最常见的骨肿瘤类型,也是该人群癌症相关死亡的第二大原因。大多数OS起源于长骨,如股骨远端和胫骨近端。它具有高度侵袭性,转移率约为20%,最常转移至肺或其它部位的骨骼。OS的起源尚不清楚,大多学者认为其起源于未分化的间充质干细胞(MSC)或更定向的骨祖细胞。目前,临床上多采用手术和化疗相结合的方式治疗OS,几乎所有患者均接受新辅助静脉注射联合化疗(多柔比星及顺铂,伴或不伴甲氨蝶呤)作为初始治疗。临床管理的进步导致OS患者的5年生存率显著提高,其5年生存率在大多数治疗中心已超过50%。然而,转移性和复发性OS患者的生存率并没有得到改善,生存率仍在20%~30%以下,这表明迫切需要更好地了解这种疾病,以期能够找到更好的治疗方法。

      揭示癌症的起源一直是一个备受关注的话题,因为它可能揭示完全治疗癌症的方法。在过去的20年中,大量研究表明只有小部分具有肿瘤起始能力的癌细胞是肿瘤发生的核心起源,这一癌细胞亚群被命名为肿瘤干细胞(CSCs)。CSCs具有正常干细胞的一些特征,它们可以通过细胞分裂自我更新以形成相同的子细胞并分化成各种类型的子代。早期对CSCs的研究一直致力于验证某些类型癌症中CSCs的存在,并寻找分离CSCs的分子标记。在概念性提出存在CSCs几年后,研究人员首先在白血病模型证实了CD34+CD38-白血病细胞具有骨髓造血干细胞特征。乳腺癌(CD44+CD24-/lowLin-)中首次鉴定出实体肿瘤CSCs,随后其它包括脑癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌和肺癌等常见肿瘤中亦鉴定出CSCs的存在,并提出了针对肿瘤的常见或独特的CSCs标记物。目前,人们普遍认为CSCs与肿瘤的病理特征密切相关,导致更差的临床预后。对常规抗癌疗法的抗性是CSCs的特征,CSCs具有抵抗放射和化疗的内源性抗性机制,这使得CSCs比分化后的细胞更具有生存优势。此外,CSCs可导致肿瘤组织中细胞的不同组成,从而导致表型变化的亚克隆的产生,从而增加在抗癌治疗后留下抗性级分的机会。因此,针对CSCs的靶向治疗有望成为治疗恶性肿瘤的重要策略。

      CSCs通常比分化的癌细胞更恶性,并且能够绕开针对肿瘤的常规治疗。证据表明,OS患者在第一次治疗完成几十年后仍可能出现远处转移,这可能进一步突出了CSCs的致瘤特征。Gibbs等首先证实了骨肉瘤肿瘤干细胞(OSCs)的存在,他们发现了人OS组织样本和细胞系中能够在无血清条件下生长肉球或骨球的细胞亚群。Martins-Neves等随后鉴定了MNNG/HOS骨肉瘤细胞系中的细胞亚群,这些细胞表现出对化疗和辐射的治疗抗性,并表现出干细胞样特性。支持OSCs存在的其它体外研究还有在非贴壁条件下MG63细胞的肉球形成以及人和犬OS中OSCs的分离和鉴定。此外,OS中还分离出了侧群(SP)细胞。与非SP细胞相比,SP细胞的球体形成、集落形成及致瘤性更高。Yang等的研究也证实SP细胞具有自我更新的能力。

      侧群细胞(染料外排试验):CSCs的一个主要特征是它们有逃避治疗的潜力,该特征与ATP结合盒(ABC)多药外排转运蛋白如MDR1/ABCB1和BRCP1/ABCG2和ABCB5的表达增高有关。基于这一特性,通过荧光激活细胞分选,测量细胞排除DNA结合染料(Hoechst33342或Rhodamine123)的能力可用于CSCs鉴定。高表达ABC转运蛋白的细胞不含染料,在分析过程中可视为“侧群(SP)”。SP细胞表现出高水平的多药耐药性,并与CSCs有相似之处。Hoechst染料排除分析是分离耐药细胞从而建立SP细胞的常用方法。与非SP细胞相比,SP细胞的下游分析显示,ABC转运体,Oct4,Nanog基因等表达上调,球体形成增加,对阿霉素、甲氨蝶呤和顺铂的多药耐药性更高。

      保留染料试验:PKH26是一种标记SC膜的红色荧光染料,染色速度快,性质稳定,并且无细胞毒性。它能够与细胞膜脂质区稳定结合并发出红色荧光,均匀地标记在细胞膜上,并能在细胞分裂时平均分配至子代细胞内,从而在分裂快的细胞中被稀释,而保留在分裂慢的细胞中。因此,由于CSCs不对称分裂的特性,静止期的CSCs可长期保留标记。这种特性已被用来在OS细胞系中分离pkh阳性细胞。这一特性也可以解释OSCs对大多数针对快速分裂细胞的抗癌药物的耐药性,并可能解释以后的复发。了解OS异质性有助于设计结合细胞毒性药物和选择性靶向CSCs的药物的改良治疗方法。

      醛脱氢酶(ALDH):另一经常使用的方法是检测药物解毒酶ALDH的表达和活性。Honoki等检测出ALDH1高表达的MG63细胞亚群,进一步研究显示ALDH1高表达的细胞干细胞样基因(Nanog,Oct3/4,Stat3,Sox2)的表达也相对增加,对多柔比星和顺铂具有更高抗性,同时其球体形成能力增加,提示其自我更新能力增加。Wang等在OS细胞系OS99-1中的研究验证了这一点。重要的是,其后Greco等在人OS样本中也检测到ALDH高表达细胞,并且发现ALDH活性的增加与转移潜能相关。此外,使用双硫仑抑制ALDH活性导致细胞增殖减少,表明其直接靶向CSCs表型细胞。与ALDH低表达细胞相比,ALDH高表达的细胞在体内更具致瘤性并且干细胞样基因表达(Nanog,Sox-2,Oct3/4)更高。与此一致,Lu等发现与致瘤性较差的OS细胞系(如U2OS,MG63和Saos-2)相比,高致瘤性OS细胞系(ZOS,ZOSM和143B)具有更高比例的ALDH高表达细胞。

      细胞表面标志物:细胞表面标志物可以说是最具吸引力和最受追捧的CSCs鉴定方法,如CD133等,通常用于鉴别CSCs。Gemei等通过基因表达谱检测了245种膜蛋白,其中OSCs与分化细胞间差异表达的蛋白有50种。其结果为确定OSCs的细胞表面蛋白质特征提供了有价值的数据。专门针对CSCs而非正常细胞(包括干细胞)的特定细胞表面标记物将极大地简化这些细胞的分离和治疗潜力。CD133(prominin):CD133(Ac133)是prominin基因的家族成员,是一种具有3种异构体的糖蛋白,被广泛用于分离CSCs。一些研究已经将CD133阳性细胞与干细胞表型联系起来。包括CD133阳性细胞群展现的SAOS2、MG63和U2OS骨肉瘤细胞株中的干细胞样特性;干细胞特性基因Oct4、Nanog和CXCR4的mRNA表达水平升高;肺转移中更高的迁移和侵袭能力以及更高的耐药性。最近Xie等采用免疫组织化学的方法检测了28例OS和21例骨软骨瘤中CD133的表达水平。结果显示,CD133蛋白在OS组织中的阳性表达率明显高于骨软骨瘤组织(60.7%与19.0%),其在OS中的表达与Enneking分期及远处转移密切相关,可能是OS患者预后不良的潜在预测指标。

      CD117(c-kit),Stro-1:CD117和Stro-1均为MSC的标志物。Adhikari等研究发现,它们优先表达于球状及阿霉素耐药性OS细胞中,小鼠和人OS细胞系以及原代培养物中均分离鉴定出CD117/Stro-1双阳性细胞,且双阳性细胞表现出更高的球体形成能力、侵袭性、转移潜能及耐药性,并富含转移相关标志物CXCR4和耐药标志物ABCG2。此外,双阳性细胞更容易在较低的细胞数下形成肿瘤,并且与双阴性细胞相比,该CSCs组分转移潜能增加。后续研究证实了这些发现,证明了CD117和Stro-1作为鉴定和分离OSCs的分子标记物的重要性。CD271:CD271是一种神经嵴神经生长因子受体,也是骨髓MSC的标志物。Tian等研究CD271+细胞的干样表型。人OS组织中可见CD271+细胞,MNNG/HOS、U2OS、Saos2细胞系中也含有CD271+亚群。作者进一步发现CD271+OS细胞显示出CSCs的大部分特性,例如体内的自我更新、分化、抗药性和致肿瘤性。与CD271-细胞相比,Nanog、Oct3/4、STAT3、DNA-PKcs、Bcl-2和ABCG2在CD271+细胞中表达更多。该研究支持OS中含有CSCs的假说,并在一定程度上揭示了维持CSCs特性所涉及的可能机制之一。

      球体形成实验:研究人员已经通过细胞形成球体的能力鉴定了组织干细胞,并且使用这种方法评估CSCs的存在。肉瘤球(由肉瘤细胞生长的球体)可以在非黏附、无血清的条件以及用生长因子(N2、表皮生长因子等)补充培养基的实验设置下生长。其中电视剧《花千骨》中的白子画,香港唐伯虎一肖中特!Gibbs等于2005年首先使用球体形成实验分离出OSCs。Fujii等进一步表明球形细胞在免疫缺陷小鼠中具有致瘤性,并且这些细胞具有更强的耐药性,提示CSCs表型。Martins-Neves等对MNNG/HOS细胞的球体形成率进行了详细的研究,结果显示从球体中分离的细胞具有MSC特性,包括干细胞基因Oct3/4、Nanog和ABC转运体的基因表达增加,并且球形细胞对化疗和辐射具有更强的抵抗力,并且与亲代细胞相比,这些细胞在体内具有更高的致癌性。该课题组随后对同一样本采用几种不同的CSCs富集方法,实验数据表明,具有特定分子和功能特征的CSCs根据其所选用的方法而富集,因此异质性CSCs亚群可以同时存在于同一癌细胞系中,表明在OS的CSCs群体中可能存在异质性。

      化疗诱导:在难治性肿瘤患者中,存在一种耐药的肿瘤细胞亚群,因此,有研究探讨了经化疗或治疗耐药的细胞中是否可能含有CSCs。Tang等的研究结果显示经甲氨蝶呤预处理或耐药的细胞不仅表达CD117+/Stro-1+,而且在体外形成更多的球体,并且在皮下注射免疫缺陷小鼠时更易致瘤。因此,他们认为化疗富集是一种可行的、实用的OSCs富集方法。Yu等最近在顺铂耐药的143B和U2OS细胞中的研究也证实了这一点,他们发现通过活化的Notch信号通路可以富集具有CSCs特性的细胞。这些研究结果表明CSCs表型可以通过化疗诱导,而不同的化疗诱导是否会导致不同的CSCs亚群仍有待确定。

      转录因子Oct3/4、Sox2和Nanog在多种肿瘤CSCs的发生和未分化胚胎干细胞多能性的维持和自我更新中起着重要作用。Levings等构建了稳定表达人Oct4启动子驱动的GFP报告基因的骨肉瘤细胞系,其致瘤性明显高于去除GFP的细胞。Oct4/GFP+细胞也表达MSC标记物CD105和ICAM-1,并有向肺转移的倾向。Sox2在人和小鼠骨肉瘤细胞系及组织标本中均有高表达。Sox2的敲除导致骨肉瘤细胞分化增加,克隆形成、迁移和侵袭减少,同时激活Wnt通路,从而抑制肿瘤的形成。相反,缺失Sox2的骨肉瘤细胞不能形成骨球并分化为成熟的成骨细胞。这些观察结果得到了Tang等的证实,他们的实验结果表明Oct4和Sox2的过度表达导致骨肉瘤细胞系中肿瘤干细胞的富集。关于Nanog在骨肉瘤中的作用知之甚少,但研究表明它可能靶向CSCs。在骨肉瘤细胞系中添加HDAC抑制剂丙戊酸(VPA)和去甲基化剂,5’-氮杂胞苷(DAC)可诱导包括CD133,Oct4,Sox2和Nanog在内的干细胞标记物的表达增加,并且增加了对肉球和集落形成效率的能力。而二甲双胍的使用则下调多能性调节因子Oct4,Sox2和Nanog的表达,并降低球体的自我更新能力。

      转化生长因子-1(TGF-β1)是一种促进肿瘤增殖和细胞因子分泌的多效性细胞因子。TGF-β1信号转导与缺氧环境结合可显著诱导无干细胞骨肉瘤细胞的自我更新,并增强OSCs的转移潜能、耐药能力、成瘤性和新生血管生成能力。提示骨肉瘤细胞可能通过分泌转化TGF-β来维持骨髓基质干细胞的生长,促进前肿瘤细胞因子的产生。TGF-β1的作用还与未成熟或未分化细胞中Sox2的表达及Nanog和Oct4的表达略微增加有关。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在OS细胞的增殖、分化、运动和存活等过程中起着重要的作用,有研究表明其可能影响OSCs的表型:MAPK信号通路与骨肉瘤细胞侵袭过程中的细胞骨架重排有关,并且ERK/MAPK通路与参与了OSCs侵袭性和运动性的增强的差异表达蛋白有关。Notch蛋白是由相邻细胞上的配体激活的跨膜受体。激活后,Notch胞内结构域(NICD)被释放并进入细胞核,在那里调节Hey和Hes家族蛋白的表达。Notch信号通路参与了干细胞的维持。Notch信号的失调导致了骨肉瘤的发生,证明了Notch信号通路在骨肉瘤的发生和发展中的意义。此外,Notch诱导的骨肉瘤细胞系在裸鼠体内形成侵袭性高级别肿瘤;Notch激活的突变作为p53丢失驱动的骨肉瘤模型的第二次打击,显著缩短了肿瘤的潜伏期和侵袭性。同时,抑制Notch信号后,小鼠骨肉瘤细胞模型的侵袭性转移表型和ALDH活性均降低。这一发现提示Notch信号通路可能通过抑制ALDH而影响OSCs。Hedgehog通路已被证明参与调节多种肿瘤的CSCs,并且有证据表明该通路参与了OSCs的启动和调节。Wnt/β-catenin或典型Wnt信号通路调节CSCs的自我更新,参与肿瘤进展和化疗抵抗。Martins-Neves等最近的研究显示:Wnt信号通路的破坏削弱了OSCs的相关性状,Wnt信号通路的抑制导致骨肉瘤球对阿霉素的化学敏感性提高。这些数据表明Wnt/β-catenin信号是骨肉瘤潜在的治疗靶点,并为传统化疗结合该信号通路的特异性靶点提供了基础研究证明。

      CSCs利用各种机制来解除凋亡信号通路的调节,包括进入静止状态和减慢增殖速度的能力。这可以与ABC药物外排转运蛋白的过度表达相结合以增强化疗抗性。药物外排转运体的抑制可促进OSCs对阿霉素的摄取并启动细胞凋亡,而药物转运蛋白P-糖蛋白和乳腺癌相关蛋白的外排活动可促进OSCs进入静止状态。抗癌药盐霉素已被证明是OSCs在体内和体外的有效抑制剂。盐霉素抑制OSCs中Oct4和Sox2的表达,抑制其成球能力及化疗抗性,并且没有严重副作用。盐霉素还可抑制Wnt通路活性,提示Wnt/β-catenin信号通路参与盐霉素的抑癌作用。Ni等采用乳化/溶剂蒸发法制备了与CD133适配体偶联的载盐霉素的乳酸聚乙烯醇酸共聚物纳米颗粒(Ap-SAL-NP),研究证实其对CD133+的OSCs具有很好的杀伤作用。其后该课题组研究了能够同时靶向OS细胞和CSCs的EGFR适配体偶联的载盐霉素聚脂杂化纳米颗粒(EGFR-SNPs)及更进一步的包埋盐霉素的EGFR/CD133双配体聚脂纳米颗粒(CESP),实验结果提示CESP在OS细胞和CSCs中的细胞毒性优于单靶向或非靶向盐载纳米颗粒,证明由于癌细胞和CSCs之间的自发转化,同时靶向CSCs和癌细胞对于实现优选的癌症治疗功效至关重要。

      蟾蜍灵是中药蟾酥中的有效成分,蟾蜍灵处理来自MG63细胞系的OSCs可以导致球体不能贴壁分化,此时细胞稳定表达CD133和OCT-4提示允许分化的条件。蟾蜍灵在非贴壁培养体系中也可抑制球体单细胞再次形成球体,在这些细胞中也检测到增殖标志物Ki67的表达降低。该数据提示蟾蜍灵可抑制CSCs的增殖和分化。他们的进一步研究提示,蟾蜍灵可能通过调节mir-148a起到抑癌作用。BRM270是从7种中药(包括三白草、紫草、黄芩、柑橘、马齿苋、寻常紫菜属和芦荟)组成的药方中提取出的有效成分,被证明可以抑制不同癌症类型的肿瘤细胞增殖。Kwon等和Mongre等提出其抑制CSCs的NF-κB信号级联反应可能是其抑癌机制。此外,在多数人眼中,福星彩图库,片仔癀可明显抑制人OSCs裸鼠移植瘤的生长.且能够增强阿霉素的作用,其作用机制与抑制膜转运蛋白ABCB1、ABCG2的表达相关。

      生态位是干细胞所处的环境,并且负责维持独特的干细胞特性如自我更新和未分化状态。构成生态位的异质群体包括干细胞和周围分化的细胞。这种异质性网络负责控制确定干细胞命运的必要途径。CSCs存在于其独特的生态位中的概念正在迅速发展,理解和识别在这种环境中发生的过程非常重要。这种CSCs群体用于维持自我更新和分化能力的必要内在途径被认为是CSCs所处环境的结果。特定CSCs生态位提供这种群体蓬勃发展的环境的能力是癌症生物学的一个关键方面,需要进行深入研究。通过在微环境内提供适当的信号,诸如炎症、上皮至间充质转变、缺氧和血管生成的稳态过程有助于维持和控制CSCs命运。与OSCs生态位功能相关的信号通路可能为OS的治疗提供新的靶点:研究表明Hedgehog和Notch通路参与血管周围生态位,VEGF/VEGFR和SDF-1/CXCR4参与GSC生态位中的血管生成和内皮重编程。因此,抗VEGF和CXCR4可抑制肿瘤血管生成,并可能打破血管周围生态位。

      TSSC3是一种主要由甲基化调控的印迹基因。OSCs中TSSC3的表达显著低于分化的OS细胞,相反,TSSC3的过表达可增加OSCs的凋亡并抑制其耐药性。这些结果表明,OS中TSSC3的表达可被去甲基化药物所靶向。MST312和咖啡因分别是端粒酶和DNA修复抑制剂,表明它们也可能是OSCs靶向治疗的候选物。端粒酶是恶性肿瘤细胞永生化的部分原因,端粒酶活性升高与OSCs的自我更新和化疗耐药有关;咖啡因增强了阿霉素和顺铂的疗效,表明肉球细胞的耐药性与OSCs的DNA修复能力相关。其它潜在治疗药物包括表观遗传调节剂(5-氮胞苷)、抗微管药物(长春新碱)和端粒酶抑制剂(RHPS4)等。

      CSCs与恶性肿瘤的发生、复发、耐药性、侵袭和转移密切相关。因此,OSCs的靶向治疗为OS的治疗提供了一种有前景的策略。然而,这样的治疗需要准确识别和分离OSCs。目前,OSCs最有效的标志物是CD133、CD117、Stro-1和ALDH,然而仍然缺少能够特异性分离OSCs的明确标志物。将CSCs标记与成球分析和SP细胞分选相结合,可提高OSCs分离的效率和准确性。然而,球形细胞和SP细胞并非完全由CSCs组成,导致细胞类型重叠。因此,为了准确地从非OSCs中分离出OSCs,还需要进一步深入研究CSCs标记的生物学功能。此外,肿瘤细胞可以从干细胞表型中来回切换,进一步增加CSCs假说的复杂性,并提示环境压力(实验或患者中)可能是异质性和可塑性的触发因素。例如,通过化疗治疗增加的环境压力有可能诱导OS从已分化向干细胞样表型的转换。这种潜在的可塑性和许多不同的实验富集方法可能有助于了解不同研究报告的CSCs标记的变化。重要的是,似乎富集的CSCs表型可能取决于应用的分离方法,然而,需要更多的研究来验证这一点。为了开发靶向CSCs的新疗法,CSCs活动中的关键信号通路越来越受到关注。然而,相对较少的研究集中在OSCs上。TGF-β1、Sox2、β-catenin和Notch等信号通路在OSCs启动和调节中的作用已经引起广泛关注,并且这些发现很有前景。最近关于表观遗传干预的研究也令人鼓舞,尤其是印迹基因TSSC3等。OSCs生态位和微环境的影响也可以提供另一种方法来阐明有助于OSCs生成和调控的事件。

      尽管取得了一些进展,但是许多关于OCS的研究都集中在个体功能或机制上,并且研究没有相互关联。进一步的发展将需要系统和深入地了解OSCs表型的调节和维持的分子机制及其在OS中的影响,以便改善患者的预后。